맞춤형 앱을 사용하여 환자 유래 심근세포의 칼슘 과도 현상 특성화

Cara Hawey는 현재 퀘벡 주 몬트리올에 있는 McGill University의 약리학 및 치료학과 Terry Hébert 박사의 연구실에서 석사 과정을 밟고 있습니다. 그녀의 연구는 확장성 심근병증을 특성화하기 위해 환자 유래 유도만능줄기세포 심근세포(iPSC-CM)를 사용하는 데 중점을 두고 있습니다.

줄기 세포는 배아 발달과 관련하여 널리 알려져 있습니다. 그러나 줄기세포는 성인 인간에게서도 추출될 수 있습니다. 피부나 혈액과 같은 조직의 세포는 사람에게서 채취하여 유전적으로 줄기세포로 재프로그램화되어 모든 세포 유형이 될 수 있습니다. 이러한 세포를 유도만능줄기세포(iPSC)라고 합니다. iPSC는 맞춤형 질병 모델링의 강력한 도구이며 "접시 속의 질병" 모델을 개발하는 데 사용할 수 있습니다. iPSC를 심근세포로 전환하면 심장 질환의 간단한 모델을 개발할 수 있습니다. 심근세포는 심장의 수축 기능을 담당하는 심근 내의 특수 세포입니다. 이 연구에서는 환자 유래 심근세포를 사용하여 심장 근육의 수축력을 손상시키는 질병군인 확장성 심근병증(DCM)을 연구합니다.

Cara의 연구는 많은 양의 데이터를 생성하며 초기 분석 작업에 시간이 많이 걸린다는 사실을 깨달았습니다. 그 후 그녀는 분석을 자동화하고 작업 흐름을 보다 쉽게 ​​관리할 수 있도록 OriginLab에 연락했습니다. 그녀는 처음에 자신의 문제를 다음과 같이 설명했습니다. "저는 유전적으로 코딩된 형광 바이오센서를 사용하여 단일 세포 수준에서 심근세포의 칼슘 과도 현상을 추적합니다. TIFF 스택에서 형광 데이터를 추출하여 타우 붕괴, 최고점까지의 시간, 진폭과 같은 매개변수를 측정합니다. 현재 Excel 기반 데이터 분석 방법을 사용하고 있지만 칼슘 과도 상태에서 데이터를 수집하는 보다 시간 효율적이고 간단한 방법을 개발하고 싶습니다." 샘플 데이터 세트로 작업하는 Dr.

우리는 Cara에게 자신의 연구 메커니즘과 "과도 분석" 사용자 정의 애플리케이션을 사용하여 데이터를 분석하는 방법에 대해 간략하게 설명해달라고 요청했습니다.

"단일 세포 수준에서 iPSC-CM의 칼슘 과도 현상을 모니터링하기 위해 저는 근필라멘트에 위치하는 RGECO-TnT라는 유전적으로 암호화된 형광 바이오센서를 사용하고 있습니다(1). 근필라멘트는 심근세포의 수축 단위이며 다음이 있는 곳입니다. 트로포닌 복합체. 칼슘은 트로포닌 복합체와 결합하여 심근세포의 수축을 시작합니다. 형광 단백질 RGECO는 트로포닌 복합체의 구성원에 결합되어 RGECO-TnT를 만듭니다. RGECO-TnT는 칼슘 결합에 반응하여 형광을 발하는 강도 측정 바이오센서입니다. 트로포닌 복합체. 이 바이오센서는 단일 세포의 근필라멘트 수준에서 칼슘 처리를 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다."

"데이터는 Zeiss Axio Observer 완전 ​​자동 도립 현미경과 같은 형광 현미경을 사용하여 수집할 수 있습니다. DCM 환자와 건강한 대조군의 iPSC 심근세포를 광학 바닥이 있는 검은색 벽의 96웰 플레이트에 플레이팅합니다. 세포는 현미경의 가스 및 온도 제어 챔버. 적색 형광 필터와 20X 대물렌즈를 사용하여 자발적인 칼슘 과도 현상의 이미지 스택이 15초 동안 기록됩니다."

이미지 스택이 생성되면 Cara는 다중 프레임 이미지를 Origin 행렬로 가져옵니다. 그런 다음 영역 도구를 사용하여 개별 세포와 샘플 배경 형광을 선택하고 레이블을 지정합니다. 모든 매트릭스 관심 영역(ROI)에 대한 강도 데이터가 추출되고, 세포 형광이 배경 형광에 대해 정규화됩니다. 프레임 번호는 15초 시퀀스 내의 시간으로 변환됩니다.

" 그런 다음 칼슘 과도 분석 앱 (OriginLab과 공동 개발)을 실행하여 최고 시간, 50% 기준선까지의 시간, 90% 기준선까지의 시간, 최대 간 시간, 과도 기간, 최고점을 포함한 칼슘 과도 현상의 특징을 결정합니다. 높이 및 곡선 아래 영역. 단일지수 곡선 피팅은 붕괴 타우를 결정하는 데 사용됩니다. 이러한 특징은 각 개별 피크에 대해 결정되고 평균을 내서 셀당 하나의 값을 생성합니다. 이미지 스택의 모든 셀에 대한 결과는 통합 문서 요약 탭에 제공됩니다. . 이러한 특징은 환자와 환자를 비교하고 환자와 대조군을 비교하여 칼슘이 근필라멘트에서 어떻게 조절 장애가 있는지 확인하는 데 사용될 것입니다. 이 분석은 또한 만성 손상에 반응하여 시간이 지남에 따라 칼슘 처리가 어떻게 조절 장애가 될 수 있는지 확인하는 데 사용될 수 있습니다."

Cara는 칼슘 과도 분석 앱을 사용하면 창 크기를 조정하여 피크 수를 더 잘 결정할 수 있다고 지적합니다. 필요한 경우 피크 시작과 피크 끝을 조정하여 피크의 시작과 끝을 보다 정확하게 식별할 수 있습니다. "매 조정 후에 최대/최소값을 찾고 피크가 정확하게 식별되면 '계산'을 실행합니다. 요약 탭이 업데이트되고 세포에 대한 결과가 정리되어 그에 따라 비교됩니다(즉, 환자 대 대조군, 만성 치료에 대한 시간 경과에 따른 환자 반응)." 그런 다음 Cara는 OriginLab의 쌍 비교 플롯 앱을 사용하여 그룹을 그래픽으로 비교하고 통계 분석을 완료합니다.

Cara는 모든 칼슘 분석에 맞춤형 칼슘 과도 분석 앱을 사용할 계획이라고 말합니다. "이 분석법을 추가로 응용하면 잠재적인 치료법을 조사하고 칼슘 처리와 조절 장애가 있는 신호 전달 경로 및 수축 장애나 조직화되지 않은 근절과 같은 표현형과 같은 질병의 기저 기능 사이의 연관성을 도출할 수 있습니다."

또한 그녀는 연구실의 다른 사람들도 이 앱이 유용할 것이라고 기대합니다. "칼슘 과도 분석 앱을 사용하면 전압 관련 과도 현상과 같은 모든 과도 현상을 분석하고 DCM 환자 및 건강한 대조군에서 파생된 iPSC-CM의 전기 생리학적 특성을 추적할 수 있습니다."

참고자료

(1) 성인 심근세포의 근필라멘트 국소화 칼슘 역학 측정 및 비대성 심근병증 돌연변이의 영향